Kwanza kabisa, EcoR1 na Xba1 huacha miale 5' zinapochimba DNA (kama vile Nde1). Katika visa vyote viwili mwisho wa 3' umewekwa tena ndiyo sababu polyermase inaweza kuongeza besi. Pili polima zote zinaweza tu kuongeza besi kwenye ncha ya 3', kwa hivyo Klenow itaongeza besi 4 kwenye mwisho wa 3' uliopunguzwa wa tovuti zote mbili ili kutoa ncha butu.
Je, vimeng'enya vya kuzuia huacha fosfeti 5?
Vekta na viingilio vilivyoyeyushwa na vimeng'enya vya kizuizi vina marekebisho muhimu ya mwisho (5' phosphate na 3' hidroksili), huku vipande vilivyoundwa na Polymerase Chain Reaction (PCR) visiwe na.
Je, ncha butu zinaweza kuunganishwa?
Mshikamano wa mwisho butu
Ufungaji wa mwisho butu hauhusishi upatanishi wa msingi wa ncha zinazochomoza, kwa hivyo mwisho wowote butu unaweza kuunganishwa kwa ncha nyingine butu. Miisho butu inaweza kuzalishwa na vimeng'enya vya kizuizi kama vile SmaI na EcoRV.
Je, Taq polymerase hutoa ncha butu?
Ndiyo… Taq Polymerase huongeza A-Overhangs ikiwa utaendelea na hatua ya mwisho ya upanuzi ya 72 dC kwenye PCR. Hutumika sana kwa TA Cloning.
Kwa nini utumie kipande cha Klenow katika mpangilio wa DNA?
Kipande cha Klenow ni muhimu sana kwa kazi zinazotokana na utafiti kama vile: Mchanganyiko wa DNA yenye nyuzi mbili kutoka kwa violezo vyenye nyuzi moja . Kujaza ncha 3' zilizofichwa za vipande vya DNA ili kufanya 5' kuwa butu . Kumeng'enya kwa mbali inayochomoza miango 3'.